Effect of midazolam on neuronal damage in ischemic stroke rats by regulating the PINK1/PARKIN signaling pathway

健康无特定病原体级成年雄性SD大鼠（6周龄，200~230 g）在室温和光照/黑暗（12 h/12 h）交替循环的条件下喂养，并自由获得食物和水。大鼠由郑州大学（河南省实验动物中心）提供，许可证号：SCXK（豫）2022−0001，本研究实验符合《中华人民共和国实验动物指南》规定，并获得动物伦理委员会批准。

咪达唑仑注射液（国药准字H20031037，批号20211120）。

美国Selleck Chemicals公司提供自噬抑制剂（3-MA）；上海天能科技有限公司提供ECL化学发光试剂盒；Abcam公司提供PINK1、ARKIN、微管相关蛋白1轻链3（LC3）及P62一抗；上海生物工程有限公司提供线粒体提取试剂盒、TUNEL试剂盒；北京Solarbio公司提供苏木精-伊红（HE）染色液；美国Bioteke公司提供二辛可宁酸（BCA）蛋白定量试剂盒。

美国Bio-Rad公司提供凝胶电泳、转移装置；日本JEOL电子公司提供透射电子显微镜（1400PLUS型）。

大鼠适应性喂养一周后，通过中动脉阻塞法建立IS大鼠模型^[11]：将麻醉的大鼠置于立体定位框架中，颈部正中央做一切口，手术分离右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉，然后将线栓穿过颈外动脉残端插入颈内动脉，在离插入点约18至22 mm处闭塞大脑中动脉，固定2 h后，抽出线栓并缝合伤口。当大鼠出现自主向左旋转的行为，记为IS大鼠造模成功，术后死亡大鼠给予相应补充。将造模成功的大鼠随机分为IS组、药物低剂量（药物-L）、药物中剂量（药物-M）、药物高剂量（药物-H）组、药物-H+3-MA组，并以仅进行分离血管的正常大鼠为假手术组，其中药物-L组、药物-M组、药物-H组根据参考文献^[12]和前期预实验结果分别以30、60、90 mg/kg咪达唑仑进行腹腔注射给药干预，同时给予生理盐水干预；药物-H+3-MA组在给予90 mg/kg咪达唑仑腹腔注射给药的同时，以30 mg/kg 3-MA灌胃给药干预^[13]；其余各组分别以等体积的生理盐水腹腔注射、灌胃干预，每日一次，连续两周。

以有经验的测试者根据Longa方法采用双盲设计评估神经功能缺损评分，神经功能缺损评分中无神经功能缺损症状，活动正常，记为0分；大鼠左前肢不能完全伸直，记为1分；大鼠爬行时转向对侧，记为2分；自发的向左转圈或行走，记为3分；大鼠无法行走，失去知觉，记为4分。

神经功能评分结束后，随机取5只大鼠麻醉，用0.9%生理盐水经心脏灌注，然后用4%多聚甲醛灌注，直到四肢僵硬，立即取出大脑，并在4 ℃下经固定剂固定部分脑组织24 h。将脑组织包埋在石蜡中，并切成连续的冠状切片，然后将切片脱蜡、再水合并用苏木精伊红染色，于显微镜下观察并拍照。

取1.2.3中脑组织石蜡片，脱蜡后按照试剂盒要求检测TUNEL阳性细胞，并计算凋亡率，其中棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。

取部分脑组织皮质区，并以戊二醛、四氧化锇固定，经浸透、包埋、聚合后制备超薄切片，透射电镜下观察皮质区自噬小体的变化。

利用线粒体分离试剂盒提取剩余8只大鼠脑组织线粒体，在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中，在玻璃匀浆器中将脑组织匀浆并定量，将蛋白质经过常规十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离、电转移、抗体反应（PINK1、PARKIN、LC3及P62一抗）后，利用增强化学发光（ECL）试剂盒进行可视化，用荧光成像仪拍摄图像，随后用Image J软件定量分析。

采用SPSS 27.0软件分析数据，计量资料以均数$ \pm $标准差（$ \bar{x} \pm s $）表示，P<0.05时，差异有统计学意义。单因素方差分析用于多组间比较，以snk-q检验进一步两两比较。

与假手术组相比，IS组神经功能评分显著增加（P<0.001）；但经药物-L组、药物-M组、药物-H组干预后，神经功能评分逐渐降低，呈剂量依赖性（P<0.001）；与药物-H组相比，药物-H+3-MA组神经功能评分显著增加（P<0.001），见图1。

假手术组脑组织皮质区结构完整，未见细胞变性，神经元形态饱满，数量较多；而IS组皮质区结构间隙较大，结构疏松，神经元数量明显减少；药物-L组、药物-M组、药物-H组病理状况有所改善，神经元形态逐渐改善，数量逐渐增加；但药物-H+3-MA组较药物-H组皮质区结构呈筛网状，神经元存在坏死现象，见图2。

与假手术组相比，IS组神经元凋亡率显著增加（P<0.001）；但经药物-L组、药物-M组、药物-H组干预后，神经元凋亡率逐渐降低，呈剂量依赖性（P<0.001）；与药物-H组相比，药物-H+3-MA组神经元凋亡率显著增加（P<0.001），见图3、表1。

与假手术组相比，IS组脑组织皮质区自噬小体的数目增加；经药物-L组、药物-M组、药物-H组干预后，皮质区自噬小体的数目也呈现增加趋势，以药物-H组最为显著；但药物-H+3-MA组较药物-H组自噬小体的数目逐渐减少，见图4。

与假手术组相比，IS组脑组织线粒体PINK1、ARKIN、LC3及P62蛋白显著增加（P<0.001）；与IS组相比，药物-L组、药物-M组、药物-H组PINK1、PARKIN、LC3蛋白表达增加，P62蛋白显著降低，呈剂量依赖性（P<0.01或P<0.001）；与药物-H组相比，药物-H+3-MA组PINK1、PARKIN、LC3蛋白表达降低，P62蛋白显著增加（P<0.001），见图5、表2。

咪达唑仑是一种γ-氨基丁酸A苯二氮卓类受体激动剂，是诱导镇静的常用麻醉剂，咪达唑仑处理可维持树突结构，并且不影响麻醉期间的神经元发育，研究表明咪达唑仑可以保护大脑中动脉闭塞诱导的神经元变性和神经细胞凋亡^[14]。本研究发现IS大鼠神经功能评分、神经元凋亡率显著增加，HE结果显示皮质区病理损伤严重，皮质区结构疏松、间隙较大，提示IS大鼠的构建伴随着严重的神经元损伤，与杨秋怡等^[15]结果相吻合。但经不同剂量的咪达唑仑治疗后，病理损伤得到改善，神经功能评分、神经元凋亡率显著降低，呈剂量依赖性，提示咪达唑仑尤其是高剂量咪达唑仑可保护IS大鼠神经元损伤，但其机制仍未阐明。

自噬是一种基因程序化的过程，选择性自噬最典型的类型是线粒体自噬，即针对受损的线粒体进行降解，促进线粒体的更新，防止功能障碍的细胞器积累^[16-17]。在自噬过程中，LC3羧基端经剪切后形成LC3I，LC3I泛素化后形成LC3II，在自噬体膜表面附着，LC3II与LC3I比值是判断自噬体形成的标志。LC3与P62结合形成自噬小体，P62会随溶酶体的降解而降解，P62与自噬强弱呈反比^[10]。PINK1-PARKIN介导的线粒体自噬在线粒体质量控制中起关键作用，并与多种疾病相关，包括神经退行性疾病、心血管疾病以及脑缺血损伤^[18-19]。在脑缺血再灌注大鼠中，活血荣络方在一定程度上通过激活PINK1/Parkin介导的自噬抑制神经元损伤，保护大鼠受损脑组织^[20]。本研究结果发现IS大鼠自噬小体较多，线粒体中PINK1、PARKIN、LC3及P62蛋白显著增加，提示IS大鼠脑组织中自噬体增加，但并未得到及时降解；经咪达唑仑干预后，IS大鼠自噬小体逐渐增多，线粒体中PINK1、PARKIN、LC3蛋白显著增加，P62蛋白表达降低，提示咪达唑仑可通过激活PINK1/PARKIN信号通路激活线粒体自噬，并加快自噬体降解，减轻IS大鼠神经元损伤。为进一步验证实验结论，以自噬抑制剂3-MA进行回复验证，结果发现3-MA逆转了咪达唑仑对IS大鼠神经元损伤的保护作用，表明咪达唑仑改善IS大鼠神经元损伤，与激活PINK1/PARKIN信号通路有关。

综上所述，咪达唑仑通过激活PINK1/PARKIN信号通路诱导IS大鼠线粒体自噬，降低神经元凋亡，改善IS大鼠神经元损伤，为咪达唑仑治疗脑中风提供理论依据。