Using HPLC to determine antimicrobial preservatives thimerosal in eye drops

Waters高效液相色谱仪；美国赛多利斯MSE225S型电子天平。硫柳汞（含量97.0%，批号T1605112，Aladdin公司）；醋酸苯汞（纯度:97.0%，批号P27127，Sigma公司）。甲醇、三乙胺为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水。

以收集到的4个制药企业（A、B、C|、D）生产的6批滴眼液为供试品，处方中硫柳汞含量均不同（企业A双氯芬酸钠滴眼液批号150301、150802、160801；企业B阿昔洛韦滴眼液批号16090401；企业C盐酸林可霉素滴眼液批号160501；企业D苄达赖氨酸滴眼液批号3160703）。

色谱柱资生堂MGII-C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以1%三乙胺溶液（磷酸调节pH值至3.0）为流动相A，以甲醇为流动相B；按表1进行梯度洗脱；柱温为40 ℃；检测波长为222 nm；流速为1 ml/min；进样体积20 µl。

精密称取硫柳汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；另取硝酸苯汞对照品约10 mg，置100 ml量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；取上述两种液体等量混合，即得。

取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释成0.2 mg/ml的溶液作为对照品储备液；精密量取储备液适量，加水分别稀释制成20 μg/ml溶液（或根据供试品硫柳汞含量不同制备成其他相同浓度的对照品），作为对照品溶液。

取滴眼液直接进样。

精密量取“2.2.1”项下系统适用性考察溶液、对照品溶液、供试品溶液（含硫柳汞）、滴眼液（不含硫柳汞）各20 μl，按“2.1”项色谱条件进样，记录色谱图，见图1。硫柳汞对照品溶液和硝酸苯汞对照品溶液混合后生成1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐，以及其他产物，色谱图应存在4个色谱峰分别为：主峰硫柳汞、1-苯基汞-2-硫代乙基汞-水杨酸盐、硝酸苯汞以及一个杂质或其他反应产物，配制该溶液主要是考察专属性，筛选色谱柱和考察色谱系统的改变对分离的影响。图1A表明系统适用性考察用混合溶液各色谱峰之间均完全分离，系统适用性良好。图1D表明不含硫柳汞的滴眼液在硫柳汞峰处无色谱峰，不影响测定，可对未知抑菌剂的滴眼剂是否含有硫柳汞进行筛查。

取硫柳汞对照品适量，精密称定，用水稀释成每1 ml约含硫柳汞4、10、20、60、80和200 μg的溶液，按“2.1”项下色谱条件试验。以对照品的质量浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。硫柳汞回归方程为Y=54413 X–77901，r=1.0，结果表明：硫柳汞在4.3～216.7 µg/ml范围内有良好的线性关系。精密量取线性对照品最低浓度约4.3 μg/ml的溶液，测得信噪比接近10∶1，将其作为定量限溶液，即定量限为4.3 μg/ml。

精密量取“2.2.2”项下20 μg/ml硫柳汞对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算RSD。结果硫柳汞峰面积的RSD为0.2%，表明仪器精密度良好。

由于供试品溶液取原液没有制备过程，因此稳定性试验取对照品溶液进行，按“2.2.2”方法制备对照品溶液（23.2 μg/ml），取对照品溶液避光室温放置10 h，分别于1、3、5、7、9、10 h，取样分析，记录色谱图，比较硫柳汞峰面积变化情况，峰面积RSD为0.7%，显示稳定性较好。对照品溶液放置过夜后再次测定，峰面积有较明显降低，显示硫柳汞水溶液配制10小时内使用较好。

取三个企业A、B、C三批样品（批号分别为160801、16090401、160501）原液做为供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件直接进样分析，平行测定6份，按外标法以峰面积计算硫柳汞的含量，考察方法重复性。结果RSD分别为0.7%、0.2%和3.4%，表明重复性良好。

在不同的日期换用不同的液相色谱仪和实验操作者，重复“2.3.5重复性试验”的操作，按“2.1”项下色谱条件连续进样，平行测定6份，作为中间精密度，合并重复性试验的6份测定结果考察方法中间精密度，12份结果硫柳汞含量RSD分别为0.5%、0.7%和2.7%。参考《中国药典》2020年版四部^[5]指导原则9101“分析方法验证指导原则”，重复性试验精密度要求，含量为0.01%，RSD应小于4%，上述含量最大为0.015%，RSD均小于3%，表明中间精密度良好。

按B企业阿昔洛韦滴眼液处方（抑菌剂为硫柳汞，标示量为20 μg.ml⁻¹）制备，取甲基纤维素、氯化钠、无水磷酸氢二钠适量，加水稀释至1000 ml，放置过夜，即得。

精密称取硫柳汞对照品（纯度97.0%）21.77 mg，置100 ml量瓶中，加水适量，振摇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取5 ml，置50 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

精密量取对照品储备液2、5、3、5 ml，分别置25、50、25、25 ml量瓶中，加空白辅料溶液稀释至刻度，摇匀，即得80%、100%、120%、200%回收率供试品溶液（每浓度平行配制3份）。按“2.1”项下色谱条件进样20 μl，按外标法计算回收率，硫柳汞的回收率为98.3%～106.2%，平均回收率为102.1%，RSD为2.7%，结果见表3。

取“2.2.1”项系统适用性考察溶液和批号为150301滴眼液样品，考察方法耐用性。结果表明，在不同的柱温（30、35、40 ℃）、流速（0.9、1.0、1.1 ml·ml⁻¹）、流动相A的pH值（2.8、3.0、3.2、3.5）、流动相组成（初始有机相B比例40%、45%、50%、55%、60%）和不同色谱柱（资生堂公司MGII、Waters Sunfire、Phenomenex Luna）条件下测定系统适用性考察溶液，硫柳汞与各峰分离度好，样品150301批硫柳汞含量测定结果RSD为2.8%，所建立的方法耐用性良好。

取4个制药企业6批含抑菌剂为硫柳汞的样品，以样品原液做为供试品溶液（n=2）。

对照品溶液制备：针对已知抑菌剂为硫柳汞且已知浓度的样品，取硫柳汞对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成与供试品溶液中硫柳汞浓度相当的溶液；针对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂筛查硫柳汞的含量，对照品溶液浓度可采用20 μg/ml或40 μg/ml（避光保存，10 h内使用）。

按“2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算硫柳汞的含量（n=2），结果见表4。

USP收载的硫柳汞钠测定方法中，测定波长为222 nm^[12]，《中国药典》2020年版二部^[3]各论阿昔洛韦滴眼液项下硫柳汞钠测定波长为262 nm。本文采用PDA检测器扫描，显示222 nm吸收强度大于262 nm，并且这两个波长处峰对称性以及与相邻杂质的分离情况一致，因此，测定波长选择为222 nm。

本课题研究方法作为可以检测多种滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量的通用方法，需要具备普遍适用性。本课题专属性研究工作还包括将收集到的42种滴眼剂（不含抑菌剂硫柳汞，分别含羟苯甲酯、羟苯乙酯、苯扎溴铵、苯扎氯铵、三氯叔丁醇等）进样分析，考察是否在硫柳汞保留时间有出峰情况，同时回收试验将企业提供的十四种未加抑菌剂滴眼液进样分析，包含滴眼液常用的附加剂，均无干扰，方法专属性较好。

本课题研究方法拟用于各种不同活性成分的滴眼液中硫柳汞的测定，为了考察色谱条件变化对目标峰特性、分离度的影响，采用硫柳汞与硝酸苯汞混合液作为系统适用性考察溶液，硫柳汞与硝酸苯汞均在pH3.0～pH3.5、甲醇比例50%以上出峰较好，色谱峰对称性优于乙腈，因此采用pH3.0的甲醇系统作为流动相。。

本次收集的6批样品，硫柳汞含量测定结果经药检机构复核基本一致。其中只有B企业1批阿昔洛韦滴眼液（批号16090401）在《中国药典》2020年版二部有硫柳汞含量测定方法，其他5批样品质量标准中均无抑菌剂含量测定方法，对批号为16090401的样品用所建立的方法与药典方法进行了比较，结果一致。根据样品测定结果，滴眼液中硫柳汞含量普遍低于处方标示量，并且测定结果显示随储存时间长含量下降多，尤其是企业C批号为160501的滴眼剂，硫柳汞标示量为200 μg/ml，实际测定结果低于标示量的80%，为151.74 μg/ml。经分析可能是由于硫柳汞不稳定，易在贮存过程中降解或见光分解^[13]，另外有文献报道“硫柳汞作防腐剂时易与塑料瓶有反应，故用塑料瓶包装的滴眼剂不宜添加该防腐剂”^[14]，这也可能是硫枊汞实测量低于标示量的原因之一。本文样品测定中6批样品均采用低密度聚乙烯瓶包装，贮存时间过长，硫柳汞可能与药包材反应造成含量下降。故建议生产企业注意滴眼液的贮存条件，另外对产品的包装材料进行相容性研究，从而避免不适用药品包装材料对产品质量的影响。

本文建立的滴眼剂中抑菌剂硫柳汞的HPLC含量测定方法既可以对已知抑菌剂为硫柳汞和已知浓度的样品进行定量分析，亦可对未知抑菌剂种类和浓度的滴眼剂进行硫柳汞添加监督筛查及含量测定，具有准确性好、线性范围广、耐用性强、普适性高的特点，所建立方法可作为滴眼剂中抑菌剂硫柳汞含量测定通用检测方法，为抑菌剂合理使用、质量控制和安全评价提供参考。