Role of intercellular junctions in the biological behavior of SP cells of multiple myeloma

细胞株：MM细胞株RPMI 8226、U266、XG4、XG7(苏州大学生物技术研究所张学光教授惠赠)；试剂：FBS、PBS、LG-DMEM完全培养液、RPMI1640培养基（美国Gibco公司)；Midi MACs系统（德国Milteyni公司）；Hoechst33342（美国Sigma公司)；抗Cx43及GAPDH一抗（美国CST公司）；RNeasy kit试剂盒、QuantiTect reverse transcriptase kit试剂盒、TopTaq Master Mix Kit 试剂盒（美国Qiagen公司）；Cytometric Beads Array试剂盒（美国BD公司）。

参考文献[4]的方法，采用Ficoll分离MM患者及正常志愿者骨髓单个核细胞（BM-MNCs），用含10％FBS的LG-DMEM完全培养液培养，观察细胞状态，72 h后首次换液，以后根据情况每2～3 d，换液1次。待细胞生长至80%融合后，胰酶消化传代。传至第三代后收获细胞进行后续实验，剩余细胞标记后冻存于液氮罐中备用。志愿者及患者骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)的分离、扩增和鉴定在知情同意下获得，并经医院伦理委员会批准。

RPMI 8226、U266采用含有10% FBS的RPMI1640培养基培养。XG4、XG7采用含有10% FBS、1 ng/ml IL-6的RPMI1640培养基培养。原代MM细胞来自6例初诊MM患者骨髓：用Ficoll分离BM-MNCs，并用Midi MACs系统纯化，留取CD38⁺、CD138⁺细胞，操作按说明书进行，分选后的细胞采用流式细胞术（FCM）检测其纯度，CD38⁺、CD138⁺细胞≥90%，采用含有10% FBS的RPMI1640培养基培养。观察细胞状态，48 h后首次换液，以后根据情况每1～2 d，换液1次。传至第三代后收获细胞进行后续实验，剩余细胞标记后冻存于液氮罐中备用。

取对数生长期F3代MM-MSCs及ND-MSCs，用PBS洗涤后，调整细胞浓度为2.0×10⁶/ml，每取100 μl细胞悬液，分别加入PE标记的CD90、CD73、CD44、CD105、CD34、CD45及HLA-DR，阴性对照为PE标记的同型IgG，室温下孵育30 min，PBS洗涤2次后，FCM上机检测。

按文献[5]报道的方法，分别取RPMI 8226、U266、XG4、XG7及原代MM细胞，调整细胞浓度为10⁶/ml，加入浓度为1 mg/ml的Hoechst33342，调整其终浓度为5 μg/ml，混匀后置于37 ℃水浴箱中避光孵育120 min，期间数次晃动离心管。对照组于此步骤中加入终浓度为50 μmol/L维拉帕米同时孵育。离心后PBS洗涤，用含碘化丙啶(2 μg/m1)的4 ℃预冷PBS重悬细胞，并置于冰浴中。FCM上机检测，激发波长为350 nm，采集波长为450 nm(蓝光)和675 nm(红光)，通过与对照组比较，选取染色偏弱部分的细胞即为SP细胞。SP细胞分选按上述步骤准备细胞，ALTRA流式细胞仪更换鞘液并用酒精进行清洗后换为双蒸水冲洗；分别上Hoechst33342管和Hoechst33342+verapamil管进行检测，FCM选择SP分选方案，调整分选参数，全程需要振荡，分选结束后在无菌条件下分别收集主群细胞(MP)和侧群细胞(SP)，备用。

分别收集RPMI8226、SP细胞、ND-MSCs、MM-MSCs、SP细胞+ND-MSCs、SP细胞+ND-MSCs+25 mmol/L α-GA、SP细胞+MM-MSCs和SP细胞+MM-MSCs+25 mmol/L α-GA各组细胞，用预冷的PBS洗涤细胞3次，加入细胞裂解液，置4 ℃作用30 min，12000 g/min离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白浓度，加入4×SDS凝胶加样缓冲液混匀，煮沸10 min使蛋白变性。然后，行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），并转移至PVDF膜上，封闭1 h后，分别与抗Cx43及GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBS液洗涤后再与HRP标记的二抗共孵育1 h，洗涤后，应用ECL化学发光法显象和Image图象分析软件分析。

采用碘化吡啶(PI)法。实验分组：①SP细胞+MM-MSCs；②SP细胞+MM-MSCs+25 mmol/L 18α甘草次酸(α-GA)；③对照组为RPMI 8226细胞。实验设3复孔，FCM分析其DNA含量，CellQuest软件分析结果。

采用甲基纤维素半固体培养法。实验分组：①SP细胞+MM-MSC组；②SP细胞+MM-MSC+25 mmol/L α-GA组。分别调整SP细胞和MM-MSC细胞浓度为4×10⁵/ml和2.0×10⁶/ml，与等量的2%甲基纤维素混均后，接种于6孔板，每孔总体系2 ml；置饱和湿度、37 ℃的CO₂培养箱中培养，14 d取出，置倒置显微镜下记录集落数，≥50细胞为集落，≤50则为簇。

采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法。实验分组：①RPMI 8226组；②新鲜分离SP细胞组；③SP细胞+MM-MSC组；④SP细胞+MM-MSC+25 mmol/L α-GA组。收集各组细胞，操作按试剂盒说明进行。简述如下：采用RNeasy kit试剂盒提取RNA样本，取1μg RNA进行逆转录，按等量cDNA进行PCR反应。所有引物序列均由上海生物工程公司设计并合成，采用β-actin为内参。β-actin上游引物 5′-TCCTGTGGCATCCACG AAACT-3′，下游引物 5′-GAAGCATTTGC GGTGGACGAT-3′，其它引物见表1。PCR扩增条件均为：94 ℃ 5 min、94 ℃ 40 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 32 s，共35个循环。取4 μl　PCR产物、Marker 3.5 μl分别加样于2.0%琼脂糖凝胶中电泳，电压100V电泳30～60 min，紫外投射仪观察目标条带，摄影，图象分析软件Smartview2001分析处理结果。

采用CBA检测法。取对数生长期MM-MSCs，调整细胞数1×10⁵/ml 接种于6孔板，培养箱静置4 h弃上清，并将不同MM细胞按1×10⁵/ml的浓度接种该孔中，每孔2 ml，分组为：①RPMI 8226细胞；②SP细胞+MM-MSCs；③SP+MM-MSCs+α-GA（25mmol/L)；④MM-MSCs。每组设3个复孔，培养24 h后收集培养上清，利用CBA技术测定上清中IL-6、IL-10、TGFβ、bFGF和IL-17的变化。

采用annexinV/PI标记细胞流式术分析法。取对数生长期MM-MSC细胞，调整细胞数4×10⁵/孔接种于24孔板；RPMI8226或SP细胞，调整细胞数2×10⁴/孔接种于24孔板，培养箱静置4 h后去上清，分组如下：①RPMI8226；②RPMI8226+硼替佐米(BTZ)；③SP+BTZ；④SP+MM-MSC+BTZ；⑤SP+MM-MSC+BTZ+α-GA。所有实验组BTZ及α-GA的终浓度分别为20 nmol/L和25 mmol/L，培养24 h后收集细胞，FCM检测细胞凋亡，实验设5复孔。

所有数据采用Graphpad Prism 5.0 统计处理软件分析，以均数±标准差表示。组间分析采用t检验，P<0.05 为差别具有统计学意义。

分离培养获得MM-MSCs及ND-MSCs，表面抗原提示两者均为高表达CD73（98.0%）、CD44（100%）、CD90（99.8%）和CD105（100%），基本不表达CD34（0.3%）、HLA-DR（0.2%），细胞形态两者无明显差异。见表2和图1。

蛋白印迹试验证实SP细胞仅表达极少量的Cx43分子，而RPMI 8226细胞则表达较高水平的Cx43，两者具有显著性差异（P<0.001）；MM-MSCs较ND-MSCs表达Cx43明显较多，但不具有统计学意义（P>0.05）；SP细胞与MM-MSCs共培养后，其Cx43表达均有显著上调（P<0.001）；阻断GJ后，SP细胞的Cx43表达则呈现明显下调（P<0.001），详见图2。

本研究对6例MM患者的原代细胞及4种MM细胞株的检测提示，采用Hoechst 33342染色后应用FCM技术可将MM细胞分为2群，即主群细胞（MP）和侧群细胞（SP）^[6]。所有MM细胞均存在不同比例的SP细胞。MM细胞株中SP细胞含量分别为1.783 %、0.8256 %、0.082 %、0.177 %，而原代细胞不具备可重复性，鉴于RPMI 8266细胞中SP细胞含量较多，且稳定，此后实验采用的SP细胞均来自RPMI8226，详见图3。

结果分析提示SP亚群中处G0期细胞比例显著高于MP亚群，分别为(44.34±1.7) %和(28.49±1.1) % ，提示SP亚群中包含更多处静止期的MM细胞。与MM-MSCs共培养后发现MM-MSCs具有促进SP亚群细胞进入G0期的作用，其G0期细胞达(82.6±0.1) % (P<0.001)，而加入间隙连接抑制剂α-GA后，MM-MSCs对SP亚群的这一作用减弱，细胞进入增殖周期者增多，G0期细胞降至(63.42±3.86) % (P<0.01)，详见图4。

我们利用克隆形成实验分析SP细胞体外形成集落的能力，SP细胞单独培养、与ND-MSCs共培养、与MM-MSCs共培养、与ND-MSCs共培养体系中加入通道阻断剂，与MM-MSCs共培养体系中加入通道阻断剂后单克隆直径、克隆形成数、克隆形成率见表3。结果显示出与MM-MSCs共培养的SP细胞有更强的克隆形成能力。加入通道阻断剂后克隆形成能力均表现出一定程度的下降，单细胞克隆直径减小，克隆形成率降低，见图5。

CBA分析显示，MM-MSCs单独培养24 h后，其培养上清中存在高水平的IL-6，较低水平的TGF-β、bFGF和IL-17，基本无IL-10分泌；RPMI 8266细胞培养24 h后上清中可以测得较低水平的TGF-β及少量bFGF、IL-17、IL-6及IL-10；共培养24 h后，其上清中IL-6、IL-10和TGF-β水平较前明显升高（P<0.05），尤其是IL-6和IL-10水平较单独培养时显著升高（P<0.01），bFGF和IL-17共培养前后则无明显变化；加入GJ阻断剂后，细胞因子IL-6、IL-10和TGF-β的分泌有所降低（P<0.05），见图6。

RT-PCR检测发现RPMI8266存在一定量c-myc、KIF4、SOX2和Oct-4基因表达，但SP细胞亚群中该类基因表达明显上调，两者具有显著性差异(P<0.05)，将SP细胞与MM-MSC共培养后，可观察到c-myc、KIF4和SOX2基因表达的显著上调(P<0.001)，而Oct-4基因表达下调，加入GJ阻断剂后，原上调的基因均有不同程度下调，但无明显区别(P>0.05)，见图7。

体外PI/Annexin V检测显示，RPMI 8226的MP细胞对BTZ诱导的细胞凋亡敏感，而对SP细胞敏感性较差，其凋亡率分别为(66.8±0.77)%和(25.9±0.86)%，P<0.001。与MM-MSCs直接共培养后，BTZ诱导的凋亡作用较单独培养明显减弱(P<0.05)，MM-MSCs具有一定保护作用，加入GJ阻断剂后，可部分恢复MM细胞对硼替佐米的敏感性，证实MM-MSCs可保护骨髓瘤细胞免受抗肿瘤药物影响，而GJIC在其中可能起到一定作用，见图8。

MM是一种恶性浆细胞疾病，以肿瘤细胞与骨髓微环境中基质细胞的复杂的相互作用网络为特征，骨髓基质细胞可促进MM细胞的生存、增殖和药物抗性。骨髓间充质干细胞是骨髓基质细胞中最主要的干细胞群体，能够分化成多种细胞系，包括成纤维细胞、脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞。MSCs可以迁移到原发肿瘤和转移部位，这意味着这些细胞可能调节肿瘤的生长和转移。MSCs在与MM细胞相互黏附及作用过程中部分细胞特性发生改变，成为肿瘤相关BMSCs，即MM-MSCs，MM患者来源的骨髓间充质干细胞显示出功能异常，说明骨髓间充质干细胞在骨髓瘤的发生、发展中不是旁观者，它还可分泌多种细胞因子影响MM细胞的生长、生存、耐药、迁移，在疾病的发生、发展中起了重要的作用，目前成为治疗多发性骨髓瘤的新的研究热点^[7-8]。

尽管近几年MM的治疗取得了长足的进步，但目前它仍然是不可治愈的，有证据表明MM细胞之间存在异质性，尤其是可能存在MM干细胞亚群，它具有自我更新及原发耐药特性，可能是MM增殖、维持MM表型及导致疾病复发的原因，但其耐药性的机制还没有得到充分的了解^{[5, 9]}。理想的多发性骨髓瘤干细胞(MMSCs)的鉴定应依赖于MMSCs的表型，但至今MMSCs的表型尚未得到正确的定义。Goodell等通过FCM在MM细胞中分离出具有干细胞特性的SP细胞，为拓展肿瘤干细胞的研究提供了思路。目前，SP细胞和ALDH1+已经被用来鉴定MMSCs。MMSCs与骨髓微环境的复杂的相互作用维持着MMSCs的自我更新和生存。然而, MMSCs与周围骨髓微环境相互作用的分子需要进一步确认。

在过去的几年里，连接蛋白的异常表达，特别是Cx43的异常表达已经被证实与癌症复发、转移性扩散和不良预后相关。根据癌症的不同分期和类型，Cx43既可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为癌基因、生物标记物，我们需要更好地了解Cx43在肿瘤微环境中如何参与、影响肿瘤形成和进展，从而开发基于Cx43的临床可行疗法。Cx43分子在细胞表面形成通道，可使小分子和一定量大分子物质在细胞间转移，这一特性使它们存在将化疗药物直接送入肿瘤细胞内的潜力，从而成为肿瘤治疗新的非常有吸引力的靶点。

为明确MM-MSCs与SP细胞的相互作用，首先我们采用Hoechst33342标记FCM术检测骨髓瘤细胞株及新鲜MM标本，结果证实所有检测样本中均存在SP细胞亚群，4 种 MM 细胞株检测SP 细胞含量分别为1.783 %、0.8256 %、0.082 %、0.177 %，并成功分选SP细胞比例最高的PRMI8226细胞株的SP细胞。在此基础上，通过对SP亚群细胞的多种干细胞相关基因如c-myc、KIF4、SOX2和Oct-4表达分析，发现其与RPMI 8226细胞有明显不同。直接与MM-MSCs共培养后SP细胞亚群c-myc、KIF4和SOX2基因表达显著上调 (P<0.001)，而Oct-4基因表达下调，加入GJIC阻断剂后，c-myc、KIF4和SOX2基因表达尽管有所下调，但并无显著性差异。对于细胞周期的分析也证实SP细胞亚群中处G0期细胞比例显著高于MP亚群，分别为(44.34±1.7)%和(28.49±1.1)% ，提示SP细胞亚群中包含较多处静止期MM细胞，推测与该群细胞化疗敏感性差可能有关。共培养后发现MM-MSCs有促进SP亚群细胞进入G0期的作用(P<0.001)，其G0期细胞达(82.6±0.1)%，而加入间隙连接抑制剂α-GA后，这一作用减弱，细胞进入周期者增多，G0期细胞为(63.42±3.86)%。体外集落形成试验证实从MM细胞分离的SP细胞本身具有较强的集落形成能力，但在MM-MSCs存在的前提下其细胞形成的体外集落细胞数更多，胞体较大且细胞折光性强，提示细胞活力较好，培养体系中加入GJ阻断剂后体外集落形成能力均现出一定程度的下降，克隆形成率降低，单细胞克隆直径减小。

前期我们的研究证实MM-MSCs与MM细胞可形成功能性GJIC，并在多发性骨髓瘤的发病中扮演重要角色^{[2-3, 10]}，为进一步观察间充质干细胞中连接蛋白Cx43组成的细胞间隙连接在多发性骨髓瘤SP细胞生存及耐药中的作用，我们通过蛋白印迹试验证实除SP细胞基本无Cx43表达外，ND-MSCs和MM-MSCs、MM细胞株及初诊患者MM细胞均表达Cx43分子，与SP细胞相比差别显著（P<0.001）。SP细胞与MM-MSCs共培养后，其Cx43分子表达显著上调（P<0.001），加入α-GA可部分下调SP细胞的Cx43表达（P<0.001）。采用CBA技术检测共培养前后培养液中细胞因子变化，发现在直接共培养时MM-MSCs细胞因子分泌谱发生变化，在原有高水平IL-6的基础上，IL-10和TGFβ水平较前明显增加（P<0.05），尤其是IL-6和IL-10较单独培养时显著增加（P<0.01），bFGF和IL-17在共培养前后水平无明显变化，采用α-GA阻断MM-MSCs与SP细胞间的GJIC后，细胞因子IL-6、IL-10和TGF-β的分泌能力下调（P<0.05）。综上，我们认为MM-MSCs通过多种途径影响SP细胞的生物学特性，增加其干细胞相关基因表达、增加静止期细胞比例、增强其体外集落形成能力、改变细胞因子分泌，而在这一过程中Cx43分子的表达及其形成的GJIC具有重要作用。

蛋白酶体抑制剂BTZ是MM治疗的一线药物，尽管BTZ较目前其他化疗药物更为有效，但原发性或获得性耐药仍是限制其疗效的主要原因，目前对于蛋白酶体抑制剂耐药的机制仍未阐明。本研究发现尽管MP和SP细胞均对BTZ敏感，但SP细胞敏感性较差，可能与其本身极低表达Cx43部分相关，其凋亡细胞分别为(66.8±0.77)%和(25.9±0.86)%，P<0.001，经与MM-MSCs直接共培养后，BTZ诱导的凋亡作用明显减弱(P<0.05)，MM-MSCs具有保护作用，而在共培养体系中加入α-GA，可部分恢复MM细胞对硼替佐咪的敏感性，由此证实MM-MSCs促进MM SP细胞的生存，保护MM SP细胞免受抗肿瘤药物影响，GJIC在其中起到一定作用。我们前期实验提示，过表达MM细胞的Cx43可提高MM细胞化疗敏感性，但与MSCs共培养后敏感性降低，肿瘤细胞本身Cx43半通道有可能通过增加癌细胞对化疗药物的通透性来降低耐药性,但与微环境中MSCs相互作用后这一作用产生变化，但具体机制仍在进一步研究中。

本研究发现Cx43及其组成的GJIC不但影响MM细胞的迁移，而且也影响恶性浆细胞的药物敏感性，证实骨髓微环境中Cx43及其组成的GJIC在MM发生、发展中具有重要作用，在细胞因子分泌、肿瘤生长、细胞周期变化、基因表达等多个环节中影响MM细胞的生物学行为，基于我们及其他相关研究结果，我们证实MM细胞与MM-MSCs、造血细胞及细胞外基质通过粘附GJIC介导耐药，阻断肿瘤细胞与微环境的GJIC将有助于提高抗肿瘤效益。